Bài 9: Sản xuất enzyme tái tổ hợp

I. ENZYME TÁI TỔ HỢP

Enzyme tái tổ hợp là enzyme được sinh tổng hợp từ phân tử DNA tái tổ hợp đã được chuyển vào tế bào sinh vật chủ. Trong đó, phân tử DNA tái tổ hợp là phân tử DNA có từ hai nguồn gốc trở lên, một phần từ vector chuyển gene (thể truyền) và phần còn lại là DNA từ các sinh vật có nguồn gene mã hoá protein enzyme đích.

Phần lớn các enzyme tái tổ hợp được sản xuất trong tế bào chủ là các vi sinh vật do hệ gene của chúng nhỏ, đã được nghiên cứu kĩ, dễ điều khiển sinh tổng hợp protein đích. Các vector chuyển gene ở vi sinh vật cũng rất đa dạng, sẵn có và được nghiên cứu đầy đủ. Hơn thế nữa, nhiều vi sinh vật sinh trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, không đòi hỏi nguồn dinh dưỡng đắt tiền nên hiệu suất sinh tổng hợp protein enzyme cao. Các vi sinh vật điển hình dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp là Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae,...

Một số enzyme (có nguồn gốc từ động vật và thực vật) có cấu trúc bậc 2, 3 hoặc 4 phức tạp, có nhiều tiểu phần, nhiều cầu nối disulfide hoặc có gắn với coenzyme, cofactor, gắn các gốc đường,... thường khó sản xuất trong tế bào chủ là vi sinh vật. Do vậy, chúng thường được sản xuất trong các dòng tế bào chủ động vật hoặc thực vật.

II. SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ HỢP

1. Quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp

Các giai đoạn cơ bản trong quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp được mô tả trong hình 9.2.

1.1. Tạo dòng DNA tái tổ hợp mang gene mã hoá enzyme

Bước (1): Gene hay đoạn DNA mã hoá enzyme đích (enzyme cần sản xuất) có thể được tách chiết hoặc tổng hợp bằng các phương pháp khác nhau.

Bước (2): Vector (thể truyền) và DNA đích được cắt bằng cùng loại enzyme giới hạn.

Bước (3): Ghép nối vector và đoạn DNA đích đã được cắt giới hạn bằng enzyme nối để tạo vector (DNA) tái tổ hợp.

Bước (4): Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.

Bước (5): Sàng lọc, tuyển chọn dòng tế bào chủ mang vector tái tổ hợp.

Bước (6): Nhân dòng tế bào mang vector tái tổ hợp.

1.2. Chuyển DNA tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ thích hợp cho biểu hiện gene

DNA tái tổ hợp sau khi được nhân lên với số lượng bản sao lớn trong tế bào vi khuẩn cần được chuyển vào dòng tế bào biểu hiện thích hợp (động vật, thực vật hoặc vi sinh vật) bằng các phương pháp khác nhau. Các dòng tế bào tái tổ hợp này cung cấp các điều kiện đầy đủ, thuận lợi cho gene mã hoá enzyme được biểu hiện.

1.3. Biểu hiện gene và thu hồi enzyme tái tổ hợp

Dòng tế bào chủ tái tổ hợp cần được nhân lên số lượng lớn trước khi được kích hoạt biểu hiện gene. Khi mật độ tế bào đạt đến mức tối ưu, quá trình biểu hiện gene đích thành protein enzyme được kích hoạt bằng các hoá chất khác nhau (đường lactose, ethanol, methanol,...) hoặc thay đổi các điều kiện vật lí, hoá học (pH, nhiệt độ,...) tuỳ theo từng loại vector và tế bào chủ biểu hiện gene.

Enzyme tái tổ hợp có thể được sinh tổng hợp, được giữ lại bên trong tế bào chủ (enzyme nội bào) hoặc được tiết ra bên ngoài tế bào (enzyme ngoại bào). Do vậy, các phương pháp, kĩ thuật dùng trong trích li và thu hồi enzyme tái tổ hợp cũng giống như đối với enzyme tự nhiên.

1.4. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp

Enzyme tái tổ hợp thường được tinh sạch bằng sắc kí ái lực để sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, mĩ phẩm, chăn nuôi,... Nếu sử dụng làm thuốc, enzyme tái tổ hợp cần được tinh chế để có độ tinh khiết cao.

1.5. Phối chế, đóng gói và bảo quản chế phẩm enzyme tái tổ hợp

Trước khi đóng gói, chất phụ gia (một số loại đường đơn, đường đôi, polysaccharide hoặc các chất tương thích khác) được bổ sung vào chế phẩm enzyme nhằm đảm bảo ổn định đặc tính của enzyme.

Chế phẩm enzyme tái tổ hợp có thể được cô đặc hoặc sấy khô, sấy phun, sấy đông khô và được đóng gói dạng bột hoặc được giữ trong dung dịch bảo quản và đóng chai. Điều kiện bảo quản chế phẩm enzyme khác nhau tuỳ vào đặc tính của enzyme và yêu cầu ứng dụng enzyme đó.