Bài 6: Quy trình công nghệ sản xuất enzyme

I - QUY TRÌNH TỔNG QUÁT

Enzyme là protein có trong cơ thể sống, vì vậy, rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách khỏi tế bào và cơ thể. Trong sản xuất chế phẩm enzyme, việc giữ được hoạt tính enzyme là một trong những yêu cầu hàng đầu. Điều chế enzyme bằng phương pháp hoá học với số lượng lớn rất khó khăn và tốn kém nên chúng thường được thu nhận từ các nguồn sinh vật. Quy trình sản xuất enzyme từ nguồn sinh vật:

Thông thường, qua mỗi công đoạn sản xuất enzyme thì một phần hàm lượng cũng như hoạt tính của enzyme bị mất đi, giá thành cao lên do chi phí thiết bị, nguyên liệu,... Vậy làm thế nào để sản xuất được enzyme vừa đảm bảo yếu tố kinh tế, vừa đảm bảo chất lượng?

1. Giai đoạn 1: Tạo nguồn thu enzyme

Bước 1. Chọn nguồn nguyên liệu cung cấp enzyme

Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật và thực vật cũng như có trong tế bào vi sinh vật. Để thu tách được enzyme đáp ứng yêu cầu về số lượng và giá thành thì nguồn cung cấp phải chứa một lượng lớn enzyme, cho phép thu enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh sạch. Hiện nay, nguồn thu enzyme chủ yếu trên thế giới và nước ta là từ vi sinh vật.

Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật. Vi sinh vật có đặc điểm như chu kì sinh trưởng ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh, con người có thể chủ động nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện nhân tạo với chi phí thấp, sản xuất được enzyme với khối lượng lớn.

Bước 2. Nuôi cấy vi sinh vật được lựa chọn

Thông thường, vi sinh vật chỉ sản xuất ra một lượng enzyme đủ để chúng sử dụng. Do đó, để thu được nguồn enzyme lớn cần phải nuôi cấy chúng trong điều kiện môi trường đặc biệt, khi đó hàm lượng enzyme mới tăng lên đáng kể.

Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme là phương pháp nổi (phương pháp bề mặt) và phương pháp chìm (phương pháp bề sâu).

Trong phương pháp nổi, vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các chất dinh dưỡng rắn đã được làm ẩm và vô trùng, chế phẩm chứa enzyme thu được ở dạng thô (rắn).

Trong phương pháp chìm, vi sinh vật được phát triển trong môi trường lỏng được sục khí và khuấy đảo liên tục, chế phẩm chứa enzyme thu được ở dạng thô (lỏng). Mỗi phương pháp có ưu điểm và hạn chế nhất định. Phương pháp nổi cho phép thu được hàm lượng enzyme cao nhưng các giai đoạn khó tự động hoá. Phương pháp chìm thu được hàm lượng enzyme thấp nhưng lại dễ sản xuất theo quy trình tự động hoá.

2. Giai đoạn 2: Tách chiết enzyme

Bước 1. Phá vỡ cấu trúc tế bào

Enzyme thường tồn tại bên trong tế bào chất và các bào quan của tế bào (enzyme nội bào) nhưng cũng có thể được sinh vật tiết ra môi trường sống (enzyme ngoại bào). Enzyme ở vi sinh vật thường là enzyme ngoại bào. Đối với enzyme nội bào, bước đầu tiên trong quy trình thu enzyme là phá vỡ cấu trúc của các tế bào chứa enzyme. Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng biện pháp cơ học như nghiền với bột thuỷ tinh hoặc cát thạch anh,... Đối với tế bào thực vật, để phá vỡ cấu trúc tế bào hiệu quả, nên thái nhỏ mẫu và để vào ngăn đá hoặc ngâm vào dung dịch nhược trương trước khi thực hiện các biện pháp cơ học. Đối với tế bào động vật, nên cắt bỏ các mô liên kết. Ngoài ra, để tách được enzyme trong bào quan của tế bào, người ta còn sử dụng các yếu tố vật lí và hoá học khác nhau như sóng siêu âm, các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, chất tẩy rửa.

Bước 2. Tách chiết enzyme

Sau khi phá vỡ tế bào và các bào quan, enzyme được tách chiết bằng nước cất, các dung dịch đệm thích hợp hoặc muối trung tính. Ở bước này, người ta thường chiết rút và kết tủa enzyme ở nhiệt độ khoảng 3 °C đến 5 °C, quá trình chiết rút được thực hiện với thao tác rất nhanh. Tuỳ vào phương pháp chiết rút enzyme mà có thể lựa chọn một số loại hoá chất với nồng độ phù hợp như NaCl, ZnCl, CaCl2. Nếu mẫu là mô động vật hoặc mô thực vật, có thể thêm chất khử để loại màu như màu xanh của chlorophyll, màu đỏ của hemoglobin trong hồng cầu.

Sau khi tách chiết enzyme, chế phẩm thu được vẫn còn lẫn những chất khác như các protein không phải enzyme, nước và các thành phần khác của tế bào. Người ta chuyển qua giai đoạn thẩm tích dịch chiết.

Khi cần tách và làm sạch một enzyme nào đó, cần chọn và phối hợp các phương pháp khác nhau như phương pháp làm kết tủa enzyme, phương pháp hấp thụ chọn lọc, phương pháp sắc kí để xác định phương pháp phù hợp nhất. Enzyme tinh khiết có hoạt tính cao hơn nhiều so với chế phẩm khi tách chiết thô. Do quá trình làm sạch rất khắt khe và tốn kém nên enzyme tinh khiết chỉ được dùng trong y học và nghiên cứu enzyme.

3. Giai đoạn 3: Tạo chế phẩm enzyme

Enzyme sau khi được tinh sạch và cô đặc cần được lưu giữ trong điều kiện phù hợp để đảm bảo hoạt tính của enzyme không bị biến tính trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng. Chìa khoá để duy trì hoạt tính xúc tác của enzyme chính là duy trì cấu hình không gian ba chiều đặc trưng của nó. Enzyme ở dạng rắn thường ổn định hơn ở dạng dung dịch. Bột enzyme thường được tạo ra bằng phương pháp đồng khô, chúng được trộn với các vật liệu trơ như tinh bột, lactose, carboxymethyl cellulose,... để bảo vệ enzyme trong suốt quá trình sấy.

Chế phẩm enzyme có nhiều dạng khác nhau như dạng dung dịch, dạng huyền phù, dạng bột khô, dạng viên nhỏ. Enzyme dạng dung dịch hay huyền phù có nhược điểm là rất khó bảo quản, do đó người ta thường đưa chúng vào dung dịch các chất bảo quản. Bên cạnh đó, khi sử dụng, người ta cũng phải giữ nó trong điều kiện nhiệt độ nhất định, không được bảo quản ở nhiệt độ cao. Enzyme ở dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ có ưu điểm là thuận tiện trong việc vận chuyển và khả năng bảo quản rất lâu.

II – QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN MỘT SỐ ENZYME

1. Quy trình sản xuất amylase theo phương pháp nuôi cấy nổi

Amylase là một nhóm enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc hệ enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide. Để sản xuất các enzyme này, người ta cũng tiến hành các bước của quy trình sản xuất chung.

Nấm mốc Aspergillus oryzae chứa nhiều enzyme thuỷ phân nội bào và ngoại bào. Loại nấm mốc này thường xuất hiện ở các kho nguyên liệu, trong các thùng đựng cám, gạo,... để lâu và bị ẩm; trong bã bia, bã rượu, bã sắn, lõi ngô,... Chúng được dùng làm nguồn thu trong quy trình sản xuất ra các loại enzyme trên môi trường lên men nổi hoặc lên men chìm. Tuy nhiên, Aspergillus oryzae sẽ sinh ra nhiều enzyme hơn trong môi trường lên men nổi.

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên cám mì, sau đó thu dịch chiết bằng nước và thẩm tích dịch chiết, dùng ethanol 65% đến 70% hoặc acetone 60% trong môi trường pH khoảng 5,5 đến 5,6 để kết tủa dịch amylase, li tâm và sấy kết tủa sẽ thu được chế phẩm enzyme, có thể nghiền nhỏ đem bảo quản và sử dụng.

2. Quy trình sản xuất enzyme protease theo phương pháp nuôi cấy chìm

Protease là enzyme xúc tác cho các phản ứng thuỷ phân protein và các chuỗi polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là amino acid. Môi trường dùng trong sản xuất protease đối với phương pháp nuôi cấy chìm là rỉ đường, nguồn thu enzyme là nấm mốc hoặc vi khuẩn. Người ta thường dùng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng tổng hợp enzyme như amylase, protease, cellulase, lipase. Các giai đoạn trong quy trình sản xuất enzyme protease:

3. Quy trình sản xuất enzyme protease tái tổ hợp

Sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy chìm chưa đáp ứng được việc mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng nhóm enzyme này trong đời sống. Việc nghiên cứu cải thiện hoạt tính và tăng khả năng tổng hợp protease để sản xuất một lượng lớn enzyme này là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Công nghệ DNA tái tổ hợp và kĩ thuật nuôi cấy vi sinh vật là cơ sở để sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone và enzyme.

Quy trình sản xuất enzyme protease tái tổ hợp trải qua nhiều công đoạn, đòi hỏi kĩ thuật cao, nghiêm ngặt hơn quy trình sản xuất theo phương pháp truyền thống.

4. Quy trình thu nhận enzyme urease

Urease là enzyme thuỷ phân urea, được ứng dụng nhiều trong sản xuất và đời sống. Để thu enzyme urease, người ta có thể dùng nguyên liệu là vi sinh vật hay thực vật như đậu nành, đậu rựa. Trong hạt đậu rựa có tới 20% chất khô là urease, do đó, đây là nguồn nguyên liệu khá thông dụng trong thu nhận loại enzyme này.

Trong thu nhận urease, bước đầu tiên người ta xử lí hạt nghiền trong dung dịch HCl 0,4% có thêm chất tạo phức hữu cơ. Sau đó quay li tâm tách bã lấy dịch chiết thô. Đem dịch chiết xử lí nhiệt (nâng nhanh đến 60 °C, giữ trong 30 phút) rồi đem li tâm tách bỏ cặn kết tủa.

Dịch li tâm được lọc qua màng siêu lọc để loại bỏ peptide và polypeptide có trọng lượng nhỏ thu được siêu dịch lọc. Dùng acetone lạnh (tỉ lệ giữa acetone và dịch lọc là 1 : 1) để kết tủa dịch lọc, tiếp tục li tâm để tách kết tủa. Tiếp đó, chạy sắc kí trao đổi ion, phân đoạn chứa enzyme được sấy thăng hoa thu được chế phẩm ureasa có hoạt tính cao gấp 25 lần so với dịch chiết thô.