Bài 2: Phương pháp tách chiết DNA

I. NGUYÊN LÍ

Để tách được DNA tinh khiết từ tế bào, về nguyên lí, cần phải phá vỡ tế bào và tách DNA khỏi các loại protein, RNA và các chất khác liên kết với DNA.

Bước 1: Phá vỡ tế bào

Trước tiên, các tế bào cần được phá vỡ để giải phóng các thành phần của tế bào vào dung dịch tách chiết. Các tế bào động, thực vật nuôi cấy hay vi khuẩn thường tồn tại ở dạng các tế bào riêng rẽ nên việc phá vỡ tế bào thường tương đối đơn giản. Ngược lại, các mô thực vật và động vật thường cần phải được nghiền nhỏ trong nitrogen lỏng để phá vỡ cấu trúc mô trước khi phá vỡ các tế bào.

Đối với các tế bào có thành tế bào, trước khi phá huỷ màng tế bào cần sử dụng enzyme phân giải thành tế bào. Sử dụng các chất tẩy rửa như CTAB có thể phân giải lớp màng tế bào và giải phóng các thành phần tế bào vào dung dịch chiết xuất.

Bước 2: Loại bỏ protein

Phân tử DNA trong tế bào thường liên kết với nhiều protein nên muốn thu được DNA tinh khiết cần loại bỏ các protein.

Phần lớn protein được loại bỏ bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ gồm phenol và chloroform (tỉ lệ thể tích 1:1). Dung môi này gây kết tủa protein mà không kết tủa các nucleic acid (DNA và RNA). Phần dịch giàu DNA và RNA được hút ra bằng pipette. Các protein còn sót lại (do phương pháp dung môi không loại hết) được phân giải bằng enzyme protease thành các amino acid hoặc đoạn peptide nhỏ.

Bước 3: Loại bỏ RNA

RNA được loại bỏ bằng cách cho enzyme ribonuclease (như RNase A) vào dịch chiết tế bào chứa hỗn hợp DNA và RNA. Ribonuclease sẽ phân cắt các chuỗi RNA thành các ribonucleotide mà không phân giải DNA. Lúc này, dịch chiết tế bào chỉ còn toàn DNA.

Bước 4: Kết tủa và tinh sạch DNA

DNA trong dịch chiết được xử lí với ethanol lạnh để kết tủa DNA.

DNA kết tủa thường ở dạng sợi và có thể tách ra khỏi dịch chiết bằng đũa hoặc thìa.

Đôi khi, kĩ thuật li tâm có thể được sử dụng để thu DNA kết tủa ở dạng cặn lắng sau li tâm và rửa lại vài lần bằng ethanol lạnh. Cặn DNA đã tinh sạch sau đó được hoà tan và lưu giữ trong dung dịch nước có độ pH ổn định (dung dịch đệm) để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

Hỗn hợp DNA thu được sau tách chiết là toàn bộ DNA của tế bào còn được gọi là DNA hệ gene hay DNA tổng số.

II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GENE

Để phân lập từng gene riêng rẽ ra khỏi hệ gene, các nhà khoa học có thể sử dụng các phương pháp khác nhau. Gene có thể được tách trực tiếp khỏi hệ gene hoặc tách chiết một cách giản tiếp thông qua mRNA của gene.

1. Tách chiết gene trực tiếp từ hệ gene

Khi gene quan tâm (gene chuyển) có chứa trình tự nhận biết của một loại enzyme cắt giới hạn nằm ở hai đầu của gene thì có thể tách được gene ra khỏi hệ gene theo phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn.

Mỗi loại enzyme chỉ cắt DNA ở một trình tự nucleotide nhất định. Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được phân lập có tên là Hindll và cách thức hoạt động của nó đã được làm rõ vào năm 1968. 

Nhờ đặc điểm của các enzyme cắt giới hạn là luôn cắt phân tử DNA tại chuỗi trình tự đặc hiệu nên người ta có thể phân lập gene khi biết trình tự vùng biên ở hai đầu 5 và 3' của gene đó có trình tự giới hạn của một loại enzyme cắt giới hạn. Phương pháp này có thể sử dụng một hoặc kết hợp nhiều enzyme giới hạn khác nhau hoặc kết hợp với DNA methylase.

Hình dưới cho thấy gene sau khi được cắt khỏi hệ gene có thể được nhân bản tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vi khuẩn (nhân dòng gene) hoặc nhân bản trong ống nghiệm bằng PCR.

Khi ở hai đầu của một gene không có trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn thì dù không thể tách trực tiếp gene ra khỏi hệ gene, các nhà khoa học vẫn có thể tổng hợp được gene đó nhờ kĩ thuật tạo ra nhiều bản sao của gene trong ống nghiệm được gọi là phương pháp PCR.

Phương pháp này có thể nhân bản một đoạn trình tự DNA đích trong ống nghiệm (in vitro) bằng cách sử dụng cặp mỗi đặc hiệu tương ứng với đầu 5′ (mỗi xuôi) và 3′ (mỗi ngược) của đoạn DNA đích nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Các mồi PCR có thể được chế tạo gồm chuỗi nucleotide bất kì

Do đó, khi đã biết chuỗi trình tự ở hai đầu của một gene thì có thể chế tạo cặp mồi PCR có trình tự bổ sung tương ứng và phân lập qua nhân bản được gene đích từ các phân tử DNA vốn rất dài của hệ gene.

2. Tách chiết gene qua mRNA

Các gene của sinh vật nhân thực thường là gene phân mảnh vì trong vùng mã hoá chứa các intron. Nếu muốn chuyển gene của sinh vật nhân thực vào tế bào nhân sơ để nó có thể phiên mã, gene của tế bào nhân thực cần phải được loại bỏ các intron và ghép các exon lại với nhau thành một exon duy nhất.

Vùng mã hoá chỉ gồm có exon của sinh vật nhân thực, được gắn vào vector có các trình tự điều hoà hoạt động gene của sinh vật nhân sơ rồi đưa vào tế bào vi khuẩn thì gene của tế bào nhân thực mới có thể được phiên mã và dịch mã. 

Trước tiên, mRNA được tách chiết và tinh sạch. Tuy nhiên, hỗn hợp mRNA thu được thường đồng thời chứa hàng nghìn loại mRNA khác nhau.

Các mRNA này đều giống nhau khi có đuôi PolyA ở đầu 3' nên phản ứng RT-PCR dùng mỗi PolyT để nhân mạch cDNA thứ nhất liên kết bổ sung với các mạch khuôn mRNA. Mỗi gene thường có các chuỗi trình tự đầu 5' và 3 đặc trưng nên những trình tự này được dùng để thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR trong bước tiếp theo giúp nhân bản chọn lọc gene đích đặc hiệu.

Như vậy, cDNA chính là đoạn DNA chứa chuỗi nucleotide của gene mã hoá chuỗi amino acid trên phân tử protein được tế bào dịch mã. Tập hợp các cDNA (tương ứng với các gene khác nhau của một mô hoặc một sinh vật) được gọi là thư viện cDNA, phản ánh tập hợp tất cả các gene được biểu hiện ở mô (loại tế bào) hoặc sinh vật đó.