Bài 7: Quy trình công nghệ sản xuất enzyme

I. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME

1. Khái niệm và vai trò của enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học thường có bản chất là protein do tế bào sinh ra, có tác động xúc tác các phản ứng xảy ra nhanh trong các điều kiện sinh lí bình thường của cơ thể sống và bản thân enzyme không bị thay đổi khi phản ứng hoàn thành. Do đó, enzyme có thể được sử dụng nhiều lần. Enzyme có khối lượng phân tử lớn từ 20 – 1 000 kilodalton (kDa) nên không vận chuyển qua được màng sinh chất. Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn so với các tác nhân xúc tác thông thường (chất hoá học, nhiệt độ,...).

Trong tế bào, enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì các hoạt động sống thông qua một số tác động cụ thể như:

– Xúc tác các phản ứng hoá học: Nhờ có tác động của enzyme nên sự đồng hoá và dị hoá xảy ra một cách nhanh chóng trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường của cơ thể. Nếu không có enzyme thì các phản ứng sẽ không xảy ra hoặc xảy ra vô cùng chậm dẫn đến các hoạt động sống không thể duy trì.

– Kiểm soát các phản ứng hoá học đặc biệt: Nhờ có tính đặc hiệu cao nên enzyme kiểm soát được các phản ứng hoá học đặc biệt và điều chỉnh tốc độ phản ứng tương ứng với điều kiện trao đổi chất của cơ thể.

2. Đặc điểm của enzyme

– Có hoạt tính mạnh: Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các phản ứng có sự xúc tác của enzyme đều diễn ra với tốc độ nhanh. Hoạt tính của enzyme được biểu hiện bằng số vòng quay, tức số phân tử cơ chất được chuyển hoá trong một giây bởi một phân tử enzyme.

– Có tính đặc hiệu cao: Mỗi enzyme thường có một trung tâm hoạt động có cấu trúc phù hợp với một hoặc một số cơ chất nhất định, do đó, enzyme sẽ liên kết đặc thù đối với cơ chất mà chúng tác động. Đa số enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, chỉ xúc tác cho một cơ chất nhất định. Một số enzyme có tính đặc hiệu tương đối, nghĩa là có thể tác dụng lên nhiều cơ chất có cấu trúc gần giống nhau.

– Sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme: Trong tế bào, enzyme hoạt động theo kiểu dây chuyền, nghĩa là sản phẩm phản ứng của enzyme trước sẽ là cơ chất của enzyme sau.

Ví dụ: trong hạt lúa mạch đang nảy mầm, amylase phân giải tinh bột thành maltose, sau đó maltase sẽ phân giải maltose thành glucose.

– Enzyme có sự định khu trong tế bào: Trong tế bào, enzyme có thể ở dạng hoà tan trong tế bào chất hoặc được định khu trong các bào quan. Enzyme được tổng hợp trong tế bào trên các ribosome và được sử dụng trong tế bào (enzyme nội bào) hoặc được tiết ra khỏi tế bào (enzyme ngoại bào).

– Hầu hết các enzyme có nguồn gốc tự nhiên đều không độc. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và trong y học.

– Enzyme chịu sự tác động của một số yếu tố: nhiệt độ, pH, áp suất,.. Mỗi enzyme hoạt động tối ưu trong những điều kiện nhất định, ở những môi trường không thích hợp, enzyme sẽ mất hoạt tính.

3. Cơ sở khoa học của ứng dụng công nghệ enzyme

Dựa trên sự hiểu biết về enzyme, người ta đã đưa ra một số cơ sở khoa học của ứng dụng công nghệ enzyme như sau:

– Enzyme là chất xúc tác sinh học do tế bào tiết ra. Do đó, người ta có thể thu nhận enzyme từ việc tách chiết từ cơ thể sinh vật. Trong đó, vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme dồi dào. Trong tương lai, con người hướng đến việc thu nhận enzyme từ các vi sinh vật sống trong môi trường khắc nghiệt để sản xuất được chế phẩm enzyme có độ bền cao hơn.

– Enzyme có thể giữ được hoạt tính xúc tác ngay cả khi ở ngoài tế bào.

– Mỗi enzyme có hoạt tính xúc tác đặc hiệu cho một phản ứng nhất định.

– Tuỳ mục đích sử dụng, mỗi chế phẩm enzyme được sản xuất phải đảm bảo một số yêu cầu nhất định về chất lượng, độ bền, hoạt tính,..

II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME TỰ NHIÊN

1. Quy trình chung

Enzyme thường có bản chất là protein nên rất dễ bị mất hoạt tính khi bị tách ra khỏi tế bào và cơ thể. Việc mất hoạt tính có thể do nhiều yếu tố khác nhau như độ pH, nhiệt độ cao, kim loại nặng, áp suất cao, các chất oxi hoá và chất khử, mất cofactor,... Do đó, trong sản xuất enzyme, việc giữ được hoạt tính enzyme được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu. Để hạn chế tối đa việc giảm hoặc mất hoạt tính enzyme trong quá trình sản xuất, người ta thường tiến hành theo một quy trình nghiêm ngặt, trong đó sử dụng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau.

a. Chọn nguồn nguyên liệu

Việc điều chế enzyme bằng phương pháp hoá học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém. Trong khi đó, enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sinh vật sống nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh vật để quá trình sản xuất dễ dàng và giảm chi phí. Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme để đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguồn nguyên liệu được lựa chọn có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng.

b. Tách chiết enzyme

Enzyme là các phân tử có kích thước lớn nên không thể di chuyển qua màng của các bào quan, màng sinh chất và thành tế bào. Vì vậy, để thu nhận enzyme nội bào thì bước đầu tiên cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa các enzyme.

Đối với tế bào thực vật, người ta thường cắt nhỏ và cho vào ngăn đá hoặc cho vào dung dịch nhược trương trước khi nghiền bằng biện pháp cơ học. Thu nhận enzyme từ tế bào thực vật tương đối khó khăn do sự hiện diện của thành tế bào, không bào. Đối với tế bào động vật, trước tiên cần cắt nhỏ để loại bỏ các mô mỡ và mô liên kết. Sau đó, tiến hành xử lí các mô trong thiết bị đồng hoá (là thiết bị dùng để phá vỡ các liên kết của các phân tử). Cuối cùng, tiến hành li tâm để loại bỏ các thành phần thừa của tế bào.

Đối với tế bào nấm men, người ta có thể tiến hành lắc với hạt thuỷ tinh (đường kính 1 mm); sử dụng một số hoá chất như toluene, EDTA 15 mM, mercaptoethanol 2 % để phá vỡ thành tế bào. Sau đó, cho li tâm để thu nhận enzyme.

Đối với tế bào vi khuẩn, nhiều phương pháp được sử dụng để phá vỡ tế bào như phương pháp cơ học (nghiền bi; sử dụng chất trợ nghiền như bột thuỷ tinh, cát thạch anh; đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá ở áp suất cao); phương pháp vật lí (dùng sóng siêu âm); phương pháp hoá học (dùng các loại dung môi như acetone, glycerol; chất tẩy rửa; lysozyme;...).

c. Tinh sạch enzyme

Tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ các thành phần không phải là enzyme (nước, ion khoáng, chất hữu cơ,...) của tế bào ra khỏi enzyme. Để loại bỏ các chất này ra khỏi enzyme đòi hỏi phải có hiểu biết về enzyme, nắm vững quy trình kĩ thuật và phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.

Để loại bỏ muối và các tạp chất có khối lượng phân tử thấp, người ta thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng, hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex, hoặc dùng túi thẩm tích cleophan để loại bỏ các chất này.

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có khối lượng phân tử cao khác, người ta thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường; phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ; các phương pháp sắc kí (sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, sắc kí loại trừ phân tử, sắc kí ái lực,...); điện di; phương pháp lọc gel.

d. Tạo chế phẩm enzyme

Sau khi đã được làm tinh sạch và cô đặc đến nồng độ thích hợp, enzyme sẽ được bảo quản ở những điều kiện nhất định sao cho hoạt tính của enzyme không bị thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng. Hầu hết enzyme sẽ bị mất hoạt tính rất nhanh, số ít có thể duy trì được vài tuần hoặc vài tháng. Vì vậy, muốn đạt được mục tiêu bảo quản và sử dụng lâu dài, điều quan trọng là cần phải duy trì hình dạng của enzyme. Để làm được điều này, người ta có thể sử dụng các chất phụ gia, chỉnh sửa các liên kết cộng hoá trị hoặc cố định enzyme. Có nhiều phương pháp khác nhau được dùng để cố định cấu trúc của enzyme như sử dụng các muối vô cơ ((NH,),SO KH,PO); dùng các polyols có khối lượng phân tử thấp (glycerol, sorbitol và manitol); đông khô để tạo bột enzyme;...

2. Sản xuất enzyme protease từ nấm mốc

Nhóm enzyme protease có vai trò cắt đứt các liên kết peptide trong quá trình thuỷ phân các phân tử protein, chuỗi polypeptide thành các sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Chế phẩm protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, mĩ phẩm, dệt, thuộc da, y học,...

Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, tiến hành hấp thanh trùng ở nhiệt độ khoảng 120 °C trong 40 phút. Tiếp đến, để nguội đến khoảng 30 °C rồi cho Aspergillus oryzae (với tỉ lệ khoảng 0,5 – 2 %) vào môi trường và tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 36 – 60 giờ. Sau đó, tiến hành thu nhận chế phẩm enzyme.

3. Sản xuất enzyme bromelain từ dứa

Bromelain là một nhóm enzyme có nguồn gốc thực vật, trong cấu tạo có chứa nhóm sulfhydryl (-SH), có khả năng phân giải protein. 

Sau khi xay nhuyễn quả hoặc thân, chồi dứa, tiến hành lọc lấy dịch và đem li tâm dịch lọc với tốc độ 6 000 vòng/phút để loại bỏ các chất xơ, sẽ thu được dịch li tâm có chứa bromelain. Bổ sung vào dịch li tâm các dung môi hữu cơ (acetone, ethanol) hoặc muối ammonium sulfate để gây kết tủa và thu được chế phẩm enzyme thô. Tiến hành tinh sạch enzyme bằng thẩm tích (sắc kí hoặc lọc qua sephadex) để thu nhận chế phẩm bromelain tinh khiết.

4. Sản xuất enzyme pectinase từ nấm mốc

Pectinase là enzyme xúc tác cho quá trình thuỷ phân pectin (một loại polysaccharide có trong hầu hết các loại thực vật). Sự thuỷ phân pectin thường diễn ra trong quá trình chín của quả, do đó, đây là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm.

Sau khi nuôi cấy Aspergillus awamori một thời gian trong điều kiện môi trường thích hợp, ta tiến hành tách chiết enzyme. Sản phẩm thu được đem sấy khô thành chế phẩm enzyme thô. Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết cần tiến hành trích li bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ (rượu ethanol 75 % hay isopropanol 55 – 57 %) hoặc dùng muối amonium sulfate. Tiến hành li tâm để tách kết tủa ra khỏi dung dịch, sấy kết tủa rồi nghiền nhỏ để thu được pectinase.

III. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ HỢP

1. Quy trình chung

Công nghệ DNA tái tổ hợp (kĩ thuật di truyền) là công nghệ sử dụng các nguyên lí của thao tác gene để tạo nên các phân tử DNA tái tổ hợp từ các nguồn DNA khác nhau. Thông thường, phân tử DNA tái tổ hợp gồm có gene mã hoá các protein mong muốn (của tế bào cho) và DNA đóng vai trò là vector biểu hiện gene (của tế bào vật chủ).

Vật chủ được dùng trong kĩ thuật di truyền thường là các loài vi sinh vật như E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae,... vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh, điều kiện nuôi cấy đơn giản. Enzyme tái tổ hợp là enzyme được tạo ra nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp. Việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme mang lại nhiều lợi ích như chủ động được nguồn nguyên liệu cung cấp enzyme, nâng cao hiệu suất sản xuất và chất lượng enzyme, dễ dàng công nghệ hoá quy trình sản xuất, giảm giá thành sản phẩm.

2. Sản xuất enzyme protease tái tổ hợp từ nấm mốc

Sau khi chuyển DNA tái tổ hợp vào trong tế bào chủ, dòng tế bào chủ cần được nhân lên với số lượng lớn. Tiếp theo, tạo điều kiện cho sự biểu hiện gene để tổng hợp protease bằng các tác nhân vật lí (nhiệt độ, pH,...) hoặc các chất hoá học (carbohydrate, ethanol,...). Công đoạn tách chiết enzyme từ dịch nuôi cấy tiến hành tương tự như các enzyme tự nhiên.