Bài 5: Các giai đoạn của công nghệ tế bào động vật
Nội dung lý thuyết
I. CÁC GIAI ĐOẠN CỦA CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Giai đoạn chuẩn bị mẫu và môi trường nuôi cấy
- Mẫu nuôi cấy là mô hoặc cơ quan, các mảnh mô nhỏ hoặc các mẫu được lấy từ cơ thể sinh vật (mẫu sinh thiết).
- Phương pháp cơ học (cắt nhỏ mô) áp dụng trong hầu hết các quy trình nuôi cấy.
- Trong nuôi cấy tế bào, sau khi cắt, mẫu được xử lí với enzyme để phá vỡ liên kết giữa các tế bào, liên kết giữa tế bào và chất nền ngoại bào và giải phóng tế bào ra môi trường. Sau khi phản ứng trypsin hoá hoàn toàn và tế bào được phân tách, huyết thanh được bổ sung để trung hoà hoạt tính enzyme.
- Mẫu tế bào thu được sau đó sẽ được sử dụng cho giai đoạn tiến hành nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với thành phần dinh dưỡng và các chất bổ sung phù hợp với mục tiêu và kĩ thuật nuôi cấy được áp dụng.
- Dựa vào mục đích nghiên cứu hoặc sản xuất, quá trình nuôi cấy được thực hiện với các mẫu khác nhau: nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mảnh mô, nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy tạo cơ quan.
2. Giai đoạn nuôi cấy
- Dựa vào mục đích nghiên cứu hoặc sản xuất, quá trình nuôi cấy được thực hiện trên các mẫu khác nhau: nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mảnh mô, nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy tạo cơ quan.
- Để tạo các dòng tế bào, nuôi cấy tế bào được tiến hành qua các giai đoạn nuôi cấy sơ cấp và nuôi cấy thứ cấp (nuôi cấy liên tục).
Nuôi cấy sơ cấp
- Đây là bước khởi đầu của nuôi cấy tế bào.
- Mẫu nuôi cấy là mộ, mảnh cắt mô hoặc cơ quan trên môi trường ngoài cơ thể.
- Trong môi trường dinh dưỡng phù hợp, các tế bào sau khi tách khỏi mô tiếp tục tăng trưởng và phân chia.
- Sản phẩm của nuôi cấy sơ cấp là dịch nuôi sơ cấp hoặc đơn lớp tế bào, giống tế bào ở mô của cơ thể.
- Dịch nuôi sơ cấp ban đầu thường không đồng nhất, sau một thời gian, dòng tế bào đại diện ở mô được nuôi cấy trở nên vượt trội.
- Dịch nuôi sơ cấp chỉ duy trì trong thời gian ngắn do các tế bào dừng phân chia (già hoá) sau một số lần phân bào.
- Nuôi cấy sơ cấp cung cấp mô hình cho nghiên cứu các đặc tính sinh lí, sinh hoá của tế bào và tác động của thuốc, độc tố đối với tế bào.
Nuôi cấy thứ cấp
- Để duy trì khả năng sống và phân chia của tế bào trong thời gian dài, cần bổ sung môi trường chất dinh dưỡng. Vì vậy, nuôi cấy thứ cấp được thực hiện bằng cách chuyển một phần dịch nuôi sơ cấp sang môi trường dinh dưỡng mới, nhờ đó tạo ra lượng lớn tế bào (dịch nuôi thứ cấp).
- Quá trình chuyển một phần dịch nuôi sang môi trường nuôi cấy mới để tế bào tiếp tục tăng sinh được gọi là cấy chuyền.
- Tế bào tăng trưởng và dịch nuôi thứ cấp có thể tồn tại trong thời gian dài hơn so với tế bào trong dịch nuôi sơ cấp do được cung cấp chất dinh dưỡng mới vào những khoảng thời gian đều đặn. Thời gian giữa các lần cấy chuyền phụ thuộc vào dòng tế bào và tốc độ tăng trưởng.
- Ví dụ: Tế bào ung thư cổ tử cung người HeLa và tế bào Vero (có nguồn gốc từ mô thận của khỉ xanh châu Phi) cần khoảng 4 ngày đến 1 tuần để cấy chuyền; Nguyên bào sợi HEL (tế bào nguyên bào sợi từ phổi ở thai người) cần 10 – 14 ngày cho mỗi lần ở cấy chuyển.
- Dựa vào đặc tính, nguồn gốc mô và khả năng thích ứng của tế bào trong quá trình tăng trưởng và phân chia trong môi trường nuôi cấy, có thể thực hiện kiểu nuôi cấy huyền phù hoặc nuôi cấy đơn lớp.
Nuôi cấy huyền phù
- Trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng và được khuấy, các tế bào phân chia và duy trì trong bình nuôi tạo nên dịch huyền phù tế bào. Nuôi cấy huyền phù tạo nên dịch chứa các tế bào được nuôi cấy tách rời nhau hoặc tạo thành đám trôi nổi trong môi trường nuôi.
- Một số loại tế bào phù hợp với kiểu nuôi cấy huyền phù, như các tế bào bắt nguồn từ mô máu (tế bào bạch cầu, tế bào lympho) do chúng có đặc tính không phụ thuộc dính bám.
Nuôi cấy đơn lớp
- Nhiều loại tế bào có tính phụ thuộc dính bám. Do đó, khi được nuôi trên cơ chất tạo nên bề mặt phù hợp, chúng có thể dính bám và lan rộng, hình thành đơn lớp tế bào. Nuôi cấy đơn lớp được thực hiện với các tế bào bắt nguồn từ mô rắn như phổi, thận, nguyên bào sợi.
- Sản phẩm của nuôi cấy tế bào thứ cấp là các dòng tế bào.
- Các dòng tế bào nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lí của tế bào; nghiên cứu vi sinh học, ảnh hưởng của bức xạ, sàng lọc thuốc, tác nhân ung thư, tác nhân đột biến,..
3. Giai đoạn thu nhận sản phẩm công nghệ tế bào
3.1. Thu nhận dòng tế bào
- Từ quá trình nuôi tế bào sơ cấp hoặc từ các dịch nuôi tế bào thương mại có sẵn, dịch nuôi được nuôi cấy thứ cấp (cấy chuyền).
- Hệ thống nuôi cấy tế bào trên cơ chất nhân tạo sẽ thu nhận dòng tế bào dính bám hoặc trên môi trường lỏng sẽ thu nhận dịch huyền phù tế bào trôi nổi.
- Dịch nuôi được duy trì trong các bình nuôi cấy bằng kĩ thuật cấy chuyền.
- Sản phẩm thu được từ quá trình cấy chuyền là dòng tế bào ổn định, thường là tế bào động vật có vú hoặc tế bào côn trùng.
- Với các mục đích khác nhau, dòng tế bào được tiếp tục xử lí bằng kĩ thuật phù hợp và thu nhận sản phẩm cuối cùng.
Dòng tế bào biến đổi gene
- Các kĩ thuật chuyển gene được sử dụng để đưa gene ngoại lai vào tế bào nuôi cấy.
- Trong công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào nuôi cấy và biểu hiện protein mục tiêu trong môi trường phù hợp.
- Sản phẩm nuôi cấy là enzyme hoặc các protein để định hướng sản xuất thuốc.
- Dòng tế bào chuyển gene có thể được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc, chức năng protein.
Dòng tế bào bất tử và dòng tế bào lai bất tử
- Dòng tế bào bất tử được thu nhận bằng các phương pháp khác nhau như: nuôi cấy mẫu mô ung thư; chuyển gene virus; gây đột biến trên tế bào nuôi cấy; chuyển gene mã hoá protein quy định khả năng bất tử, như telomerase.
- Ngoài ra, công nghệ tế bào lại (hybridoma) cũng được áp dụng để thu được dòng tế bào B trong công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng.
3.2. Nuôi cấy mảnh mô
- Các mảnh mô được chuẩn bị bằng cách cắt thành khối nhỏ (dày khoảng 0,5 – 1,0 mm), sau đó đặt vào giếng nuôi cấy và ủ trong một thời gian.
- Môi trường nuôi cấy thường cần có cơ chất ngoại bào để tế bào dính bám.
- Nuôi cấy mảnh mô có thể tạo điều kiện cho tế bào ở mỗi trường tương tự như trong cơ thể. Nuôi cấy mảnh mô thường áp dụng với mô phôi hoặc mô sơ sinh để nghiên cứu sự phát triển phôi, ứng dụng trong cấy ghép tế bào vào mô nuôi cấy; nghiên cứu đặc điểm tăng trưởng của tế bào ung thư; đặc biệt là so sánh tốc độ tăng trưởng và hình thái tế bào ung thư với tế bào bình thường.
- Ngoài ra, nuôi cấy mảnh mô còn được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gene; cơ chế tác động của các yếu tố điều hoà tăng trưởng trong các giai đoạn phát triển phôi; nghiên cứu đáp ứng với thuốc điều trị ung thư và xác định các chỉ thị sinh học (biomarker).
- Tuy nhiên, do thời gian nuôi cấy mảnh mô chỉ là vài tuần nên khó áp dụng để nghiên cứu các bệnh mạn tính hoặc không phù hợp cho các nghiên cứu cần thời gian dài.
3.3. Nuôi cấy cơ quan
- Toàn bộ cơ quan từ phôi hoặc một phần cơ quan trưởng thành được cắt từ sinh vật để bắt đầu nuôi cấy in vitro.
- au khi được cắt với kích thước phù hợp, thường dày dưới 1 mm, mẫu mô của cơ quan được đặt vào giá thể (gel thạch bán lỏng, huyết tương sợi hoặc màng lọc vi lỗ) và ủ trong bể ủ CO2 ẩm.
- Môi trường nuôi cấy cơ quan được thay mới, bổ sung thường xuyên để đạt điều kiện dinh dưỡng và trao đổi khí phù hợp cho sự hình thành và phát triển cơ quan.
- Phân tích mô học, đánh dấu và chụp phóng xạ chụp ảnh, nhuộm tiêu bản mẫu mô cho biết cấu trúc và chức năng sinh học. Do được duy trì cấu trúc ba chiều (3D) các đặc tính mô học, cơ quan nuôi cấy có thể biểu hiện các đặc tính như trong cơ thể.
- Nuôi cấy cơ quan được ứng dụng để nghiên cứu chức năng của tế bào, kiểm tra tác động của các yếu tố bên ngoài, nghiên cứu phát sinh hình thái, biệt hoá và chức năng của các cơ quan.
3.4. Nuôi cấy tạo mô hoặc cơ quan
- Các kiểu nuôi cấy huyền phù hoặc đơn lớp tế bào (nuôi cấy 2D) nhằm tăng sinh tế bào, nhưng không hình thành tương tác giữa các tế bào và tương tác giữa tế bào với chất nền (matrix). Do đó, tái lập cấu trúc 3D là phương pháp nuôi cấy để các tế bào được nuôi cấy sắp xếp lại và tạo nên các cấu trúc tương tự cơ quan trong cơ thể.
- Ba hướng phát triển mô hình nuôi cấy tế bào 3D, bao gồm:
(A) Tạo khối tế bào: các tế bào đơn từ các dòng tế bào hoặc dịch nuôi sơ cấp có thể tập hợp thành các cấu trúc 3D;
(B) Đồng nuôi cấy kiểu cơ quan: các lát cắt mô từ cơ quan được nuôi ngoài cơ thể;
(C) Nuôi cấy tạo các cơ quan thu nhỏ: các tế bào sơ cấp được tách từ mô mới được nuôi trực tiếp ở dạng các cấu trúc đa bào 3D.
II. VÍ DỤ VỀ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
- Tế bào nuôi cấy có thể được sử dụng như những nhà máy sản xuất các protein đặc thù.
- Sản xuất kháng thể đơn dòng là một ứng dụng thực tiễn của công nghệ tế bào động vật.
- Kháng thể đơn dòng là protein có khả năng liên kết đặc hiệu chỉ với một protein kháng nguyên, do đó được sử dụng cho nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị bệnh.
Nuôi cấy sơ cấp tế bào lympho B và tạo tế bào lai
- Tế bào lympho B bình thường sinh kháng thể nhưng có tuổi thọ hữu hạn khi nuôi cấy in vitro.
- Để sản xuất kháng thể đơn dòng, cần tạo ra dòng tế bào lympho B sinh kháng thể có tính bất tử.
- Bằng cách dung hợp (lai) tế bào lympho B bình thường từ động vật đã được gây miễn dịch với các tế bào u tuỷ (các tế bào lympho biến đổi trở nên bất tử không tạo kháng thể), tế bào lai (hybridoma) được tạo ra có đặc tính mới.
- Trong thực tế, khi dung hợp tế bào u tuỷ với tế bào lympho B từ lá lách chuột được gây đáp ứng miễn dịch với protein kháng nguyên đặc thù (kháng nguyên A), tế bào lai tạo thành có khả năng tăng sinh vô hạn và sản xuất kháng thể đơn dòng mong muốn.
Tách và chọn lọc các tế bào lai
- Tế bào lai (tế bào dung hợp) lẫn trong hỗn hợp chứa các tế bào bố mẹ và các tế bào dung hợp không phù hợp.
- Quá trình tách các tế bào lai được thực hiện bằng cách nuôi hỗn hợp các tế bào này trong môi trường chọn lọc.
- Khi đó, chỉ các tế bào lai sinh trưởng được nhờ các đặc điểm mới của chúng, còn tế bào lympho B hay tế bào ung thư tuỷ ban đầu không thể sinh trưởng được.
Nuôi cấy tế bào và kiểm tra kháng thể đơn dòng
Sản xuất kháng thể đơn dòng
- Tế bào lại được nuôi cấy với quy mô lớn để tạo ra lượng lớn kháng thể đơn dòng.
- Để sản xuất quy mô lớn, nuôi cấy được thực hiện trong dịch nuôi ở bình phản ứng sinh học có thể tích lớn.