Bài 3: Công nghệ gene

I. KHÁI NIỆM VÀ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ GENE

1. Khái niệm

Công nghệ gene là quy trình công nghệ sử dụng các kĩ thuật DNA tái tổ hợp để thay đổi kiểu gene và kiểu hình của sinh vật. Ứng dụng công nghệ gene vào thực tiễn được gọi là công nghệ sinh học.

Nguyên lí của công nghệ gene có thể tóm tắt như sau: Tách gene cần chuyển (gene chuyển) ra khỏi tế bào cho rồi dùng kĩ thuật PCR tạo ra nhiều bản sao. Đồng thời tách DNA dùng làm vector ra khỏi tế bào. Sau đó xử lí gene chuyển và vector bằng cùng một loại enzyme cắt giới hạn và trộn các loại phân tử này với nhau cùng với enzyme ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp. DNA tái tổ hợp được truyền vào tế bào nhận để tạo ra tế bào chuyển gene.

Sản phẩm của công nghệ gene là các protein của gene chuyển được tạo ra trong tế bào nhận, có thể được sử dụng làm thuốc chữa bệnh hoặc cho các mục đích khác nhau. 

2. Quy trình công nghệ

Quy trình công nghệ gene rất phức tạp nhưng có thể tóm tắt qua ba bước như minh hoạ ở Hình 3.1.

Bước 1: Phân lập gene chuyển

Gene chuyển hay gene đích là gene cần chuyển từ sinh vật này sang sinh vật khác.

Trước hết, gene chuyển phải được phân lập ra khỏi hệ gene của tế bào cho gene, sau đó, bằng các kĩ thuật khác nhau mà gene chuyển được nhân bản tạo ra các bản sao giống hệt nhau. Nếu gene chuyển lấy từ tế bào nhân thực với mục đích chuyển vào tế bào nhân sơ thì trước khi gắn vào vector gene chuyển cần phải được loại bỏ các intron.

Người ta thường phân lập gene chuyển bằng cách phân lập mRNA trưởng thành của gene chuyển (không còn các intron), sau đó cho phiên mã ngược thành cDNA.

Bước 2: Cài gene cần chuyển vào vector

Gene đích được cài vào vector (thể truyền) để thu được DNA tái tổ hợp. Tuỳ theo mục đích của công nghệ gene và đối tượng nghiên cứu mà người ta có thể sử dụng các loại vector khác nhau. 

Nếu muốn chuyển gene vào tế bào động vật và thực vật, các nhà khoa học thường sử dụng vector là các loại virus vốn sống trong các tế bào động, thực vật và có khả năng tích hợp hệ gene của chúng vào hệ gene của tế bào động, thực vật. Nhờ vậy, gene chuyển mới có thể gắn được vào nhiễm sắc thể của tế bào động, thực vật và hoạt động bình thường.

Để cài gene chuyển vào vector, các nhà khoa học phải sử dụng cùng một loại enzyme cắt giới hạn khi cắt gene chuyển và vector để tạo ra cùng loại đầu dính. Sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn, các đoạn DNA từ hai nguồn được trộn với nhau và sử dụng enzyme ligase để gắn chúng với nhau tạo ra DNA tái tổ hợp.

Bước 3: Chuyển vector vào tế bào nhận

Vector tái tổ hợp được chuyển vào tế bào nhận bằng nhiều cách khác nhau. Các vector là plasmid hoặc virus có thể tự biến nạp và tải nạp vào tế bào. Một số trường hợp phải dùng kim tiêm hoặc súng bắn gene để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào.

II. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA CHUYỂN GENE

1. Vai trò của vector

Khi một đoạn DNA ngoại lai xâm nhập vào bên trong tế bào thì hệ thống enzyme của tế bào sẽ phân huỷ giống như cơ chế miễn dịch ở người chống lại các tác nhân bên ngoài xâm nhập vào cơ thể. Muốn gene chuyển vào tế bào có thể tồn tại, tái bản và phiên mã, dịch mã được thì gene phải được cài vào hệ gene của tế bào chủ hoặc ở trong một cấu trúc cho phép gene tồn tại, nhân bản, phiên mã và dịch mã bình thường được gọi là vector.

2. Đặc điểm của vector

Tất cả các vector đều có ba đặc điểm chung về cấu tạo (thuộc tính phân tử):

- Có một trình tự khởi đầu tái bản: Trình tự này được bộ máy tái bản của tế bào chủ nhận biết, chẳng hạn như trình tự Ori ở E. coli hay ARS ở nấm men, nhờ vậy vector được tái bản mỗi khi được chuyển vào tế bào chủ.

- Có một (hoặc một số) gene chỉ thị chọn lọc: Gene này biểu hiện như một gene trội, nhờ đó, nó có thể giúp phân biệt được tế bào mang vector với các tế bào không mang vector. Ở vi khuẩn, trong các gene chỉ thị chọn lọc phổ biến có các gene kháng chất kháng sinh như gene amp^ kháng ampicillin, gene tet" kháng tetracycline. Ở nấm men có các gene phục hồi khuyết dưỡng như gene Leu+ (tổng hợp amino acid leucine) hay gene Ura (tổng hợp uracil). Khi các vector mang các gene chỉ thị chọn lọc được chuyển vào các tế bào nhận vốn không có khả năng kháng kháng sinh hoặc khuyết dưỡng thì chỉ các tế bào chứa vector mới có thể sống được trong môi trường có chất kháng sinh hoặc thiếu chất dinh dưỡng. Ở cơ thể đa bào (như vật nuôi và cây trồng), một nhóm gene chỉ thị chọn lọc được ưa dùng là các gene phát huỳnh quang (dưới ánh sáng UV) hoặc phát sáng (trong tối), như gene GFP (protein phát huỳnh quang lục) được phân lập từ sứa hay gene phát sáng được phân lập từ đom đóm. Lúc này các cơ thể chuyển gene thành công (mang vector) sẽ dễ dàng được nhận biết khi quan sát dưới đèn UV (với gene GFP) hoặc trong tối (với gene phát sáng từ đom đóm).

- Có vị trí nhân dòng: Đây là điểm để cài các đoạn DNA ngoại lai vào vector. Về bản chất, nó là một đoạn trình tự DNA ngắn trên vector, chứa một số vị trí giới hạn đặc thù. Thường thì mỗi vector chỉ có một vị trí giới hạn duy nhất đối với một loại enzyme giới hạn nhất định, nhưng nó đồng thời có nhiều vị trí giới hạn tương ứng với các enzyme giới hạn khác nhau. Trong quy trình công nghệ gene cơ bản nhất, vector được cắt tại vị trí giới hạn duy nhất của nó bằng enzyme giới hạn phù hợp, rồi cài vào vị trí đó đoạn DNA ngoại lai cũng được cắt bởi cùng loại enzyme giới hạn.

Đến nay đã có nhiều loại vector được phát triển, bao gồm: các vector plasmid, các vector virus, cosmid, vector Ti plasmid và các nhiễm sắc thể nhân tạo. Các loại vector khác biệt nhau về một số thuộc tính phân tử, loại tế bào chủ và kích thước tối đa các đoạn DNA đích mà chúng có thể nhân dòng. Tuỳ thuộc vào kích thước đoạn DNA đích và loại tế bào chủ mà người ta chọn loại vector phù hợp.

Vector có nguồn gốc từ plasmid của E. coli và vector pUC19 dài 2 686 bp và có một số đặc điểm giúp nó nhân dòng gene hiệu quả ở E. coli như có thể được tái bản tới 100 bản sao trong mỗi tế bào, mang gene chỉ thị chọn lọc amp^R và chứa một vùng mang nhiều vị trí giới hạn của các enzyme giới hạn khác nhau gọi là vị trí đa nhân dòng (MCS).

Vị trí MCS được thiết kế thành một phần của gen LacZ⁺ mã hoá enzyme β – galactosidase của E. coli. Trong tự nhiên, enzyme này chuyển hoá lactose thành galactose và glucose. Tuy vậy, trong điều kiện in vitro, enzyme này còn có hoạt tính xúc tác chuyển hoá một cơ chất không màu tên là X–gal thành một hợp chất có màu xanh tím có tên là 5 – bromo – 4 – chloro – indigo. Nhờ vậy, có thể phân biệt được vi khuẩn mang vector với các vi khuẩn không mang vector tái tổ hợp khi trong môi trường có X–gal. Kĩ thuật này được gọi là sàng lọc khuẩn lạc xanh – trắng.

3. Tạo vector tái tổ hợp

Gene chuyển và vector mang gene phải được xử lí bằng cùng một loại enzyme cắt giới hạn để có cùng loại đầu dính có thể liên kết được với nhau theo nguyên tắc bắt đôi bổ sung. Liên kết phosphodiester được hình thành giữa các đoạn DNA nhờ enzyme ligase.

III. CHUYỂN GENE Ở THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT

1. Chuyển gene ở thực vật

Một trong các phương pháp chuyển gene có hiệu quả cao ở cây trồng được nhà vi sinh vật Mary Dell Chilton phát triển năm 1983, cho phép cài gene ngoại lai trực tiếp vào nhiễm sắc thể của nhiều loài cây trồng.

Phương pháp này sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vốn sống cộng sinh và gây nốt sần ở các loài cây họ Đậu. Vi khuẩn này chứa một loại plasmid mang gene gây nốt sần gọi là plasmid Ti. Ngoài các gene gây khối u, plasmid Ti còn mang các gene mã hoá cho một số protein có vai trò chuyển một đoạn DNA của nó vào trong tế bào thực vật và cài T-DNA này vào hệ gene của thực vật.

Chilton đã cải tiến plasmid Ti bằng cách loại bỏ các gene bệnh và cài vào T-DNA của plasmid Ti đoạn trình tự gene mong muốn. Lúc này, các vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid Ti tái tổ hợp có thể chuyển và cài gene mong muốn vào cây trồng khi hạt giống, cây non hoặc tế bào nuôi cấy in vitro được ủ với vi khuẩn mang plasmid Ti tái tổ hợp.

Cho đến nay, phương pháp sử dụng vi khuẩn A. tumerfaciens để chuyển gene ở thực vật đã giúp tạo được nhiều giống cây trồng biến đổi gene (cây GMO). Tuy nhiên, do plasmid Ti thường chỉ lây nhiễm hiệu quả ở nhóm cây hai lá mầm, trong khi lây nhiễm yếu ở nhóm cây một lá mầm, nên các nhà khoa học đã phát triển một số phương pháp để nâng cao hiệu quả chuyển gene ở các cây một lá mầm, trong số đó có phương pháp sử dụng “xung điện” và “súng bắn gene”.

Vì quá trình chuyển gene cần phải đưa được đoạn DNA đích vào trong nhân tế bào, nên các phương pháp này giúp phân tử DNA có thể xâm nhập vào nhân. Nguyên lí ứng dụng của phương pháp “xung điện” để chuyển gene ở thực vật về cơ bản cũng giống như ở vi khuẩn E. coli.

Phương pháp “súng bắn gene”, “súng bắn gene” dùng áp lực của dòng khí trơ (Helium) để đẩy các hạt kim loại siêu nhỏ được bọc bởi các đoạn DNA mang gene, đâm xuyên qua thành và các lớp màng đi vào nhân. Khi đoạn DNA ngoại lai đã ở trong nhân thì sẽ có cơ hội để gene chuyển kết hợp vào hệ gene của tế bào chủ theo cơ chế tái tổ hợp.

Nhờ các gene chỉ thị chọn lọc được dung hợp cùng gene chuyển, người ta có thể nhận biết các tế bào đã được chuyển gene thành công. Từ các tế bào chuyển gene, sử dụng công nghệ nuôi cấy tế bào để tái sinh thành cây chuyển gene. Đến nay, công nghệ gene đã được áp dụng để tạo các giống cây trồng GMO mang các đặc tính ưu việt đa dạng khác nhau như:

- Cây trồng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường (chịu hạn, chịu lạnh, chịu mặn, chịu nhiệt).

- Giảm sử dụng thuốc trừ sâu hoá học (cây trồng kháng sâu).

- Giảm chi phí sau thu hoạch (gene chín chậm, gene kháng mọt).

- Tăng hiệu quả hấp thụ khoáng của cây (hạn chế gây xói mòn đất và bón phân).

- Tăng giá trị dinh dưỡng của cây trồng (ví dụ: giống lúa vàng mang gene quy định β–carotene là tiền chất của vitamin A).

Ngoài các ứng dụng trên, cây trồng GMO còn được sử dụng tạo ra nguyên liệu trong công nghiệp như một số dạng tinh bột dùng làm tá dược hay để sản xuất xăng sinh học.

2. Chuyển gene ở động vật vật và người 

Chuyển gene ở các tế bào động vật và người nhằm hai mục đích chính:

(1) Tạo ra các tế bào có gene được chỉnh sửa như thay thế gene bệnh bằng gene lành, làm bất hoạt hay hoạt hoá gene rồi đưa trở lại cơ thể như trong liệu pháp gene chữa bệnh di truyền

(2) tạo ra sinh vật chuyển gene hay sinh vật biến đổi gene có các đặc tính mong muốn để nghiên cứu hoặc ứng dụng trong thực tế.

Để tạo ra các tế bào chuyển gene, người ta thường sử dụng các tế bào động vật nuôi cấy rồi cho biến nạp DNA tái tổ hợp vào trong tế bào.

Vector dùng để chuyển gene cho tế bào động vật thường là các loại retrovirus. Những loại retrovirus hay lây nhiễm các tế bào động vật được sử dụng làm vector vì chúng có sẵn khả năng xâm nhập vào tế bào động vật nhờ các thụ thể đặc hiệu.

Ngoài ra, khi vật chất di truyền của virus xâm nhập vào tế bào, chúng được phiên mã ngược thành DNA và tích hợp vào hệ gene của tế bào chủ. Các nhà khoa học cần loại bỏ phần lớn các gene của virus, chỉ giữ lại những gene cần thiết cho quá trình tải nạp và tích hợp gene chuyển vào nhiễm sắc thể của tế bào.

Để tạo động vật chuyển gene thì vector mang gene chuyển cần phải được đưa vào tế bào trứng vừa được thụ tinh. Sau đó, hợp tử được nuôi cấy cho phát triển thành phôi sớm rồi cấy vào tử cung của con vật để sinh ra con vật chuyển gene. Vector mang gene chuyển thường được tiêm vào trứng bằng vi kim tiêm hoặc nhờ virus.

Chuột, thỏ, lợn, cừu, bò và cá chuyển gene đã được tạo ra nhờ công nghệ gene (trong đó trên 95% động vật chuyển gene là chuột) để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu như:

Xác định chức năng gene: Khi giải trình tự hệ gene người, các nhà khoa học có thể nhận biết được một đoạn DNA nào đó là một gene nhưng không biết gene đó có chức năng gì.

Một trong các biện pháp xác định chức năng của gene trong trường hợp này là sử dụng kĩ thuật chuyển gene. Gene cần xác định chức năng được làm hỏng rồi gắn vào vector, sau đó chuyển vào hợp tử của chuột, tạo ra sinh vật chuyển gene.

Tế bào phôi chuột chuyển gene gia nhập vào phôi chuột và tạo nên các mô, ở đó gene chuyển bị mất chức năng có thể biểu hiện ra kiểu hình đột biến, nhờ vậy người ta có thể biết được chức năng của gene. 

- Nghiên cứu bệnh học: Nhiều động vật chuyển gene được tạo ra nhằm giúp con người tìm hiểu cơ chế gây bệnh của các gene, cách các gene đóng góp vào quá trình phát sinh và tiến triển của bệnh. 

- Sản xuất chế phẩm hoặc thuốc sinh học: Thuốc điều trị bệnh có bản chất hoặc thành phần chính là các đại phân tử sinh học được gọi là “thuốc sinh học”. Cơ chế gây bệnh ở cấp phân tử của nhiều bệnh lí phức tạp ở người được công nghệ sinh học phân tử tìm ra gần đây đã khiến các thuốc sinh học ngày càng được ứng dụng rộng rãi nhờ có tính hướng đích và hiệu quả cao. 

- Mô hình thử nghiệm thuốc và vaccine: Chuột chuyển gene hiện nay được sử dụng ngày càng rộng rãi. Kết quả nghiên cứu hệ gene học so sánh giữa người và các loài động vật có vú cùng các bằng chứng khác cho thấy mức tương đồng ở cấp phân tử giữa người và chuột cao hơn so với các dự đoán trước kia. Khi bằng chứng phân tử đủ tin cậy, chuột chuyển gene có thể được sử dụng thay thế cho khỉ trong các nghiên cứu về an toàn thuốc và vaccine mới, giúp rút ngắn thời gian và chi phí phát triển thuốc và vaccine.