Bài 2. Thực hành: Tách chiết DNA

I. CHUẨN BỊ

Dụng cụ: Cối sứ, chày sứ, vải lọc (hoặc rây), dao nhỏ, cốc thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, giá đỡ ống nghiệm, pipette, đĩa đồng hồ, que tre (hoặc tăm tre) nhỏ.

Hoá chất: Nước rửa bát, nước cất lạnh, cồn ethanol 70 % lạnh, dung dịch diphenylamine.

Mẫu vật: Mô thực vật (cải thìa, xà lách) hoặc mô động vật (gan gà hoặc gan lợn còn tươi), quả dứa còn xanh.

II. CƠ SỞ KHOA HỌC

Ở tế bào nhân thực, DNA tập trung chủ yếu trong nhân tế bào, một số nằm trong các bào quan (ti thể, lục lạp). DNA trong nhân liên kết với nhiều loại protein khác nhau, được bao bọc bởi màng nhân.

Người ta có thể dùng các phương pháp cơ học, hoá học để phá vỡ thành tế bào (nếu có), màng sinh chất và màng nhân nhằm giải phóng DNA ra khỏi tế bào, loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein liên kết với DNA; các thành phần trong tế bào chất như protein, RNA, lipid,...), từ đó, thu nhận được DNA tinh sạch phục vụ cho các nghiên cứu di truyền.

II. CÁCH TIẾN HÀNH

1. Tách chiết DNA

Bước 1: Chuẩn bị mẫu vật.

- Dịch chiết nước dứa:

+ Gọt vỏ quả dứa và cắt thành những lát mỏng, nhỏ.

+ Cho vào cối sứ để nghiền nhuyễn.

+ Lọc lại bằng vải hoặc rây để thu được dịch chiết nước dứa. Bảo quản dịch chiết trong ngăn mát tủ lạnh.

- Dịch chiết mô:

+ Cắt nhỏ 100 g gan (hoặc cải) còn tươi và cho vào cối sứ cùng với 200 mL nước cất lạnh, nghiền nhuyễn trong khoảng 20 giây (lúc này hỗn hợp có dạng sệt).

+ Lọc lại bằng vải hoặc rây để thu được dịch chiết mô.

Bước 2: Tách chiết DNA ra khỏi tế bào.

- Rút dịch chiết mô vào cốc thuỷ tinh, sau đó, cho thêm vào cốc thuỷ tinh 30 mL nước rửa bát (hỗn hợp A). Dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều hỗn hợp A rồi để yên trong thời gian 10 – 15 phút.

- Dùng pipette hút 5 mL hỗn hợp A cho vào ống nghiệm, sau đó, cho thêm vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết nước dứa (hỗn hợp B). Dùng đũa thuỷ tinh khuấy thật nhẹ hỗn hợp B rồi để yên ống nghiệm trên giá đỡ trong thời gian 30 phút.

Bước 3: Kết tủa DNA.

- Nghiêng ống nghiệm chứa hỗn hợp B, rót từ từ theo thành ống nghiệm 5 mL dung dịch cồn ethanol 70 % lạnh sao cho cồn tạo thành một lớp nổi lên bề mặt hỗn hợp.

- Đặt ống nghiệm đứng thẳng trên giá đỡ. Để yên trong 5 phút, thấy xuất hiện búi kết tủa trắng đục chứa DNA nằm lơ lửng trong lớp cồn.

Bước 4: Nhận biết DNA.

- Dùng que tre (hoặc tăm tre) nhỏ đưa vào trong lớp cồn, khuấy thật nhẹ cho búi DNA bám vào que tre rồi vớt ra để quan sát.

- Kiểm chứng sự có mặt của DNA: Cho búi DNA vào trong đĩa đồng hồ, nhỏ vào 1 mL dung dịch diphenylamine. Sau một khoảng thời gian, búi màu trắng sẽ dần chuyển sang màu xanh.

2. Báo cáo kết quả thực hành

BÁO CÁO: KẾT QUẢ THỰC HÀNH TÁCH CHIẾT DNA

Nhóm: .......

Lớp: ......

Thứ ..... ngày ..... tháng ..... năm ..

Họ và tên thành viên: ........

1. Mục đích thực hiện thí nghiệm.

2. Kết quả và giải thích.

a. Trình bày kết quả tách chiết và nhận biết DNA (kèm theo hình ảnh minh hoạ).

b. Giải thích kết quả thực hành dựa trên các câu hỏi sau:

- Quá trình cắt nhỏ và giã nhuyễn gan (hoặc cải) có tác dụng gì?

- Việc cho nước rửa bát và dịch chiết nước dứa vào dịch chiết mô có tác dụng gì?

- Việc cho ethanol lạnh vào hỗn hợp có tác dụng gì?

- Tại sao khi lấy DNA bằng tăm tre cần khuấy thật nhẹ?

3. Kết luận.