Bài 2: Tách chiết DNA từ tế bào

I. NGUYÊN LÍ TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO

Tách chiết DNA là quá trình phân lập và tinh sạch DNA từ tế bào bằng các kĩ thuật vật lí hoặc hoá học. Khi tách chiết DNA, cần lưu ý tránh sự tác động quá mạnh của các tác nhân vật lí hoặc hoá học làm đứt gãy DNA. Tuy DNA có thể được thu nhận từ các nguồn khác nhau, cũng như tuy mục đích sử dụng DNA mà quy trình tách chiết có thể khác nhau nhưng đều được thực hiện dựa trên nguyên lí cơ bản là giải phóng DNA còn nguyên vẹn vào dung dịch tách chiết, loại bỏ các tạp chất để thu nhận DNA tinh sạch.

1. Bước 1: Chuẩn bị mẫu sinh phẩm

Mẫu sinh phẩm được sử dụng để tách chiết DNA có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như tế bào vi khuẩn, mô thực vật hoặc động vật.

Đối với vi khuẩn, trước khi tiến hành quy trình tách chiết cần nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận được lượng sinh khối lớn. Đối với sinh vật nhân thực, có thể thu nhận DNA trực tiếp từ các mẫu sinh phẩm như các mô thân, lá, rễ, hoa,... (ở thực vật) hoặc mẫu lông, tóc, máu, thịt, niêm mạc miệng,... (ở động vật).

Tuỳ theo mục đích nghiên cứu, có thể sử dụng các kĩ thuật tách chiết với hoá chất, dung môi thích hợp.

2. Bước 2: Li giải tế bào

Li giải tế bào là quá trình phá vỡ màng sinh chất và màng nhân (ở tế bào nhân thực) bằng các tác nhân vật lí hoặc hoá học, có thể sử dụng kết hợp các tác nhân để giải phóng các thành phần của tế bào (trong đó có DNA) vào dung dịch chiết xuất. Tuy nhiên, việc li giải tế bào cần đảm bảo DNA không bị phân huỷ bởi các enzyme.

Để phá vỡ màng tế bào và màng nhân, người ta có thể dùng các chất tẩy lưỡng cực có tác dụng liên kết với các phân tử phospholipid và các protein màng để phá vỡ cấu trúc màng.

Bên cạnh đó, người ta có thể sử dụng kết hợp với các enzyme như lysozyme, cellulase, chitinase, proteinase K, lysozyme,... để tăng hiệu quả li giải tế bào.

Do cấu trúc của các loại tế bào có sự khác nhau nên trong quá trình li giải có thể sử dụng kết hợp một số phương pháp vật lí. Đối với tế bào vi khuẩn, chúng thường tồn tại ở dạng các tế bào đơn lẻ, không có cấu trúc khung xương, không tích luỹ lipid cũng như các hợp chất sinh học thứ cấp nên quá trình tách chiết thường đơn giản.

Đối với tế bào mô thực vật và động vật có kích thước lớn nên thường phải nghiền nhỏ trong môi trường chứa nitrogen lỏng thành các hạt mịn để dễ dàng tách chiết DNA; bên cạnh đó, tế bào thực vật có thành tế bào vững chắc nên cần sử dụng thêm các biện pháp cơ học (nghiền bằng cối, dùng máy xay) hoặc sử dụng enzyme để phá vỡ thành tế bào; mỏ động vật cần được xử lí bằng enzyme để phá huỷ các mô liên kết, cắt bỏ phần mô chết và phần thừa (như mỡ).

3. Bước 3: Loại bỏ các thành phần không mong muốn

Trong tế bào còn có các thành phần khác như carbohydrate, lipid, protein, RNA....; mặt khác, DNA còn liên kết với nhiều loại protein khác nhau (như protein histone, protein điều hoà,...) nên để thu được DNA tinh khiết, người ta cần phải loại bỏ các thành phần này. Tuỳ theo từng phương pháp khác nhau mà việc loại bỏ các thành phần không mong muốn có thể được thực hiện bằng dung môi hữu cơ, gắn DNA lên cột silica, dùng các hạt từ,...

4. Bước 4: Thu nhận DNA

Để thu nhận DNA tinh khiết, người ta tiến hành rửa dịch chiết DNA để loại bỏ các tạp chất còn sót lại. Thông thường, việc loại bỏ này được thực hiện bằng cách bổ sung các chất để gây kết tủa DNA kết hợp với li tâm để loại bỏ cặn bã. DNA tinh khiết sau khi thu nhận được bảo quản trong dung dịch đệm ở –20 °C để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO

Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa dựa trên tác dụng của các chất hoá học như gây biến tính protein và làm bất hoạt các enzyme phân giải DNA để tách DNA ra khỏi các thành phần khác của tế bào và tiến hành thu nhận DNA. 

a. Bước 1: Loại bỏ các thành phần không mong muốn Để loại bỏ protein và lipid lẫn trong dung dịch, người ta có thể bổ sung vào dung dịch chiết hỗn hợp dung môi hữu cơ phenol : chloroform (tỉ lệ 1 : 1) để gây biến tính và kết tủa protein. Sau đó, tiến hành li tâm để tách protein và lipid ra khỏi hỗn hợp DNA và RNA; sau khi li tâm, thu được một hỗn dịch gồm hai pha: pha nước và pha dung môi hữu cơ. Các phân tử protein có kích thước nhỏ còn sót lại, protein liên kết với DNA chưa bị loại bỏ bằng dung môi sẽ được phân giải bằng proteinase K. Lúc này, dùng pipette hút pha nước để thu nhận hỗn hợp DNA và RNA và tiếp tục loại bỏ các RNA bằng các enzyme ribonuclease.

b. Bước 2: Kết tủa và tinh sạch DNA

Gây kết tủa nhằm mục đích tinh sạch và cô đặc các phân tử DNA. Trong bước này, người ta thường bổ sung muối vào dịch chiết để trung hoà điện tích âm của DNA, nhờ đó làm giảm khả năng hoà tan của DNA. Tiếp theo, bổ sung alcohol (ethanol 70 % hoặc isopropanol 35 %) để gây kết tủa DNA ở 4 °C trong khoảng 30 phút. Tiến hành li tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn chứa DNA. Sau khi thu nhận, cặn DNA được rửa sạch trong ethanol 70 % vài lần để loại bỏ isopropanol và muối để thu được DNA tinh khiết. DNA tinh khiết được bảo quản để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

2. Tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica

Tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica dựa trên hoạt động của muối chaotropic làm phá vỡ mạng lưới các liên kết hydrogen, tương tác Van Der Walls và tương tác kị nước nhằm tạo điều kiện cho DNA liên kết với màng silica. Sau đó, tiến hành rửa các tạp chất còn sót lại và li tâm để thu nhận DNA tinh sạch nhằm mục đích sử dụng tiếp theo hoặc lưu trữ ở –20 °C. 

a. Bước 1: Gắn cột

Hỗn hợp chứa DNA sau quá trình li giải sẽ được chuyển lên màng silica thông qua quá trình li tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút, các muối chaotropic có vai trò hỗ trợ cho quá trình liên kết giữa DNA với các hạt silica và được giữ lại, còn các thành phần khác (polysaccharide, protein,...) không thể gắn lên màng thì sẽ đi qua màng và chuyển xuống đáy ống li tâm. Tiến hành loại bỏ tạp chất và tách DNA ra khỏi dung dịch.

Trong quá trình này, ethanol hoặc isopropanol thường được sử dụng để tăng khả năng gắn của DNA vào silica. Nồng độ cồn sẽ được tối ưu hoá để đảm bảo cho DNA không bị ảnh hưởng, nếu quá nhiều ethanol sẽ làm đứt gãy DNA; ngược lại, nếu quá ít ethanol sẽ gây khó khăn cho quá trình rửa sạch các muối trên màng.

b. Bước 2: Rửa

Sau khi li tâm, hầu hết các thành phần không mong muốn đã được tách khỏi DNA nhưng trên màng silica vẫn có thể dính một số tạp chất còn sót lại. Quá trình rửa nhằm loại bỏ các chất này để thu được DNA tinh sạch. Thông thường, có hai cách rửa được sử dụng tuỳ theo mẫu sinh phẩm ban đầu.

– Mẫu sinh phẩm lấy từ vi khuẩn (DNA plasmid) chứa ít protein thì chỉ cần rửa bằng ethanol.

– Mẫu sinh phẩm lấy từ thực vật, động vật có chứa nhiều protein, các sắc tố,... được rửa hai lần. Lần một, rửa bằng dung dịch chứa một ít muối chaotropic để loại bỏ protein và các sắc tố; sau đó, rửa lần hai bằng ethanol 70 % để loại bỏ muối và các thành phần còn lại.

c. Bước 3: Thu nhận DNA

Sau khi rửa bằng ethanol, người ta thường tiến hành li tâm để là làm khô cột silica, việc này giúp loại bỏ ethanol và tăng hiệu suất quá trình rửa giải (giải phóng DNA khỏi màng silica). Để tách chiết DNA ra khỏi màng silica, người ta thường dùng dung dịch muối Tris 10 mM ở pH 8 – 9 do DNA có tính ổn định và tan nhanh trong đệm ở pH kiềm nhẹ. Mặt khác, người ta cũng có thể dùng nước để rửa giải, tuy nhiên các phân tử DNA có khối lượng phân tử lớn có thể không bị hydrate hoá hoàn toàn do nước thường có pH thấp (khoảng 4 – 5) sẽ làm giảm hiệu suất quá trình rửa giải. Quá trình rửa giải sẽ đạt hiệu quả cao nếu cho dung dịch rửa giải vào và ủ trong khoảng 1 – 2 phút rồi mới đem li tâm để thu dịch.