Bài 3: Công nghệ gene và thành tựu

I. CÔNG NGHỆ GENE

Trước đây, việc cải biến các giống cây trồng, vật nuôi thường được tiến hành thông qua phương pháp lai hữu tính, cá thể lai được tạo ra mang các đặc tính tốt của cả bố và mẹ. Tuy nhiên, phương pháp này có một số điểm hạn chế như: con lai vẫn mang các tổ hợp gene không mong muốn từ bố và mẹ; khó áp dụng khi lai khác loài do con lai khác loài thường bất thụ hoặc do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học,... giữa các loài không phù hợp với nhau.

Nhờ sự phát triển của các lĩnh vực sinh học, công nghệ gene ra đời đã khắc phục những trở ngại nói trên. Công nghệ gene là quy trình công nghệ dựa trên nguyên lí tái tổ hợp DNA và nguyên lí biểu hiện gene, sản phẩm tạo ra gồm DNA tái tổ hợp và protein tái tổ hợp với số lượng lớn trên quy mô phòng thí nghiệm hoặc quy mô công nghiệp, được sử dụng để phục vụ cho đời sống thực tiễn. Có thể nói công nghệ chuyển gene là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.

Trong công nghệ gene, gene cần chuyển (gene ngoại lai) là một đoạn DNA được phân lập từ hệ gene của tế bào cơ thể sinh vật (cùng loài hoặc khác loài), thu nhận từ ngân hàng gene hoặc được tổng hợp nhân tạo. Vector tái tổ hợp mang gene cần chuyển có thể được biến nạp (chuyển) trực tiếp hoặc gián tiếp vào các dòng tế bào chủ, kĩ thuật này được gọi là chuyển gene hay biến nạp di truyền.

Các dòng tế bào chủ được biến nạp DNA tái tổ hợp có tên gọi khác nhau tuỳ từng nhóm sinh vật:

– Vi khuẩn tái tổ hợp: vi khuẩn được biến nạp vector tái tổ hợp.

– Nấm men, nấm sợi tái tổ hợp: các vi nấm được biến nạp vector tái tổ hợp.

– Tế bào tái tổ hợp: các tế bào người, tế bào động vật, tế bào thực vật mang gene ngoại lai.

II. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA CHUYỂN GENE

Trong kĩ thuật chuyển gene, gene chuyển sau khi được biến nạp phải có mặt trong tất cả các tế bào của cơ thể sinh vật chuyển gene, được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và phải được biểu hiện thành protein tái tổ hợp có chức năng sinh học. Do đó, chuyển gene được tiến hành dựa trên cơ sở khoa học là sự biến nạp, khả năng di truyền và biểu hiện của gene chuyển trong tế bào chủ. Để gene chuyển được biến nạp vào tế bào chủ cần sử dụng vector chuyển gene. Sau khi biến nạp, để gene chuyển được biểu hiện và di truyền qua các thể hệ, cần sử dụng vector biểu hiện gene và tế bào chủ phù hợp.

1. Vai trò và đặc điểm của vector chuyển gene

a. Vai trò của vector chuyển gene

Việc chuyển gene từ tế bào này sang tế bào khác sẽ gặp nhiều khó khăn nếu chỉ thực hiện bằng phương pháp biến nạp trực tiếp đoạn gene cần chuyển vào tế bào:

– Gene sau khi xâm nhập vào tế bào không thể tự tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận.

– Gene tự do không thể tiến hành quá trình nhân đôi và sẽ mất đi trong phân bào do bị phân huỷ bởi các enzyme.

– Mỗi gene thường chỉ có một bản sao trong tế bào nên không thể tiến hành cho biểu hiện gene nếu số lượng bản sao của gene quá ít.

Như vậy, để chuyển gene giữa các tế bào cần có sự tham gia của một“yếu tố trung gian” chính là các vector chuyển gene; vector có vai trò mang, vận chuyển gene vào tế bào nhận và biểu hiện gene.

b. Đặc điểm của vector chuyển gene

Vector chuyển gene được sử dụng thông thường là một phân tử DNA dạng vòng nhằm giữ được cấu trúc nguyên vẹn do khắc phục được sự cố đầu mút (hiện tượng ngắn dần đoạn đầu mút của DNA dạng không vòng sau mỗi lần nhân đôi), có khả năng tồn tại và nhân đôi độc lập trong tế bào, mang được gene cần chuyển. Một vector chuyển gene cần phải đảm bảo được các yêu cầu sau đây:

– Có trình tự khởi đầu sao chép (điểm Ori) để có thể tiến hành nhân đôi trong tế bào nhận.

– Có các trình tự nhận biết (palindrom) là vị trí enzyme cắt giới hạn (restrictase) nhận biết để cắt mở vòng DNA và gắn với gene cần chuyển, vị trí này thường nằm xa điểm Ori. Mỗi trình tự nhận biết chỉ đặc hiệu với một loại enzyme cắt giới hạn; tuy nhiên, trên một vector có thể chứa nhiều trình tự nhận biết đứng liên tiếp nhau tương ứng với các loại enzyme cắt giới hạn khác nhau được gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning sites – MCS).

– Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gene cần chuyển. Ngoài promoter, cần có thêm các trình tự nucleotide khác cần thiết cho sự biểu hiện của gene (như ribosome binding sites – RBS là vùng liên kết với ribosome để dịch mã).

– Đảm bảo được sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hoặc khi gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận.

– Có các gene chỉ thị (gene đánh dấu – marker genes) để nhận biết được tế bào nhận có chứa DNA tái tổ hợp. Thông thường, gene chỉ thị được sử dụng là các gene quy định khả năng kháng thuốc kháng sinh trên plasmid của vi khuẩn như gene kháng ampicilline (amp"), gene kháng tetracyline (tet"), gene mã hoá enzyme ß-galactosidase (lacZ-); ở nấm men, gene chỉ thị được sử dụng là trp1 và ura3 mã hoá các enzyme cho phép tế bào nấm men sản xuất tryptophan và uracil trong môi trường khuyết dưỡng các chất này.

– Có nhiều bản sao để thu nhận với số lượng lớn và đảm bảo sự khuếch đại của gene được gắn vào.

c. Đặc điểm của plasmid pBR322 ở vi khuẩn E. coli

Ý tưởng về vector chuyển gene dựa trên các đặc điểm của plasmid ở tế bào vi khuẩn: plasmid là các đoạn DNA mạch vòng có kích thước nhỏ, tồn tại và nhân đôi độc lập với DNA vùng nhân, mang một số gene của vi khuẩn và các gene này có thể biểu hiện tạo protein. Do đó, plasmid của vi khuẩn là vector chuyển gene đầu tiên được sử dụng trong công nghệ gene. Hình 3.3 mô tả một phân tử plasmid pBR322 (có 4 363 cặp nucleotide) ở vi khuẩn E. coli, đây là một trong những vector được sử dụng phổ biến trong công nghệ gene. Trên plasmid này chứa:

- Hai gene kháng thuốc kháng sinh ampicilline (amp^R) và tetracyline (tet^R).

- Có trình tự khởi đầu sao chép (điểm Ori) để có thể tiến hành nhân đôi trong tế bào nhận.

- Các trình nhận biết bởi enzyme cắt giới hạn và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gene kháng thuốc kháng sinh. 

Plasmid này có khả năng sao chép độc lập với DNA vùng nhân của tế bào, đảm bảo được sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hoặc khi gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận, tồn tại với số lượng trung bình từ 20 – 30 bản sao trong mỗi tế bào. Trong những điều kiện nuôi cấy nhất định, có thể khuếch đại có chọn lọc làm tăng số plasmid đến hơn 1.000 bản sao trong một tế bào.

2. Một số vector chuyển gene phổ biến

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát triển cũng như cải biến được nhiều loại vector khác nhau tuỳ thuộc vào kích thước đoạn gene cần chuyển, loại tế bào nhận.

- Vector plasmid: là các phân tử DNA có kích thước nhỏ, dạng vòng, có nguồn gốc từ vi khuẩn, tuỳ từng loại plasmid mà chúng có số lượng bản sao khác nhau, thường chứa các gene chỉ thị là gene quy định tính kháng thuốc kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các vector plasmid không ngừng được cải tiến và mang nhiều đặc tính quý; tuy nhiên, plasmid chỉ có thể mang các đoạn gene có kích thước nhỏ. Vector plasmid gồm ba thế hệ:

+ Plasmid thế hệ thứ nhất: là dạng plasmid tự nhiên (pSC101), do có rất ít các đặc điểm cần thiết nên hiện nay không còn được sử dụng.

+ Plasmid thế hệ thứ hai: là các plasmid nhân tạo có cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid thường được sử dụng là pBR322 có nguồn gốc từ một plasmid nhỏ ColE1, plasmid này được tạo nên từ nhiều đoạn của các plasmid khác nhau để vừa mang gene kháng thuốc, vừa có các trình tự nhận biết cho các enzyme cắt giới hạn.

+ Plasmid thế hệ thứ ba: là các plasmid đa năng và chuyên dụng, phù hợp cho việc sử dụng nhiều loại enzyme cắt giới hạn khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker. Các plasmid này có kích thước nhỏ, sao chép nhanh, tạo số lượng bản sao lớn. Một số plasmid thế hệ thứ ba như: plasmid dòng pUC (pUC18, pUC19,...), plasmid dòng Gemini (pGEM3, pCR 2.1).

- Vector virus: là các virus có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (như phage A, phage M13,...) do chúng có thể tiến hành quá trình tải nạp để chuyển gene vào tế bào vi khuẩn. Việc chuyển gene nhờ phage có nhiều ưu điểm như: dễ xâm nhập và gene có khả năng nhân lên nhanh chóng trong tế bào chủ, có thể mang các gene có kích thước lớn. Tuy nhiên, thao tác gắn gene phức tạp hơn so với dùng plasmid.

– Ti plasmid: là plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, được sử dụng rộng rãi trong chuyển gene ở thực vật.

3. Tạo vector tái tổ hợp

Sau khi tách vector và gene cần chuyển, các nhà khoa học tiến hành gắn gene cần chuyển vào vector để tạo vector tái tổ hợp, quá trình này được thực hiện nhờ sử dụng kết hợp enzyme cắt giới hạn và enzyme nối (ligase). Tuỳ theo mỗi loại vector chuyển gene mà các bước tạo vector tái tổ hợp có sự khác biệt.

Sau khi được tạo thành, plasmid tái tổ hợp sẽ được chuyển vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp bởi hoá chất hoặc xung điện. Hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao.

Trên thực tế, các vector nhân dòng gene (có vai trò chuyển và nhân dòng gene mong muốn trong tế bào chủ) có thể được cải biến thành vector biểu hiện gene bằng cách gắn thêm các trình tự điều hoà như trình tự khởi đầu hoặc kết thúc phiên mã, trình tự khởi đầu dịch mã phù hợp; nhờ đó, các enzyme và ribosome của tế bào chủ có thể nhận biết và tiến hành quá trình biểu hiện gene được chuyển.

4. Tế bào chủ

Trong công nghệ gene, loại tế bào chủ được chọn thường phụ thuộc vào mục đích của việc phân lập gene đích. Nếu mục đích tách gene để phân tích cấu trúc thì chỉ là một hệ thống đơn giản, dễ sử dụng (như các loài vi khuẩn); nếu mục đích để biểu hiện thông tin di truyền ở một sinh vật nhân thực bậc cao (thực vật, động vật) thì đòi hỏi phải có một hệ thống đặc thù để biểu hiện gene.

a. Tế bào chủ là sinh vật nhân sơ

Yêu cầu đầu tiên đối với tế bào chủ là dễ nuôi cấy và có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ thu nhận được nhiều loại vector. Vật chủ được sử dụng phổ biến là vi khuẩn E. coli, chúng có quá trình phiên mã và dịch mã diễn ra đồng thời với nhau nên thuận lợi cho việc nhân dòng gene. Ngoài E. coli, một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm vật chủ cho công nghệ gene như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces; tuy nhiên, các loại vi khuẩn này có ít vector, cũng như quá trình đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ còn gặp khó khăn.

b. Tế bào chủ là sinh vật nhân thực

Năm men S. cerevisiae là một vi sinh vật nhân thực được sử dụng phổ biến trong công nghệ gene vì có đặc điểm dễ nhân giống, tạo được các đột biến như vi khuẩn và thuận lợi trong các nghiên cứu phân tích di truyền học. Một số loại nấm khác cũng được dùng trong công nghệ gene là A. nidulans và N. crassa. Bên cạnh đó, các tế bào thực vật và động vật cũng có thể được sử dụng như các vật chủ trong các thí nghiệm công nghệ gene; tuy nhiên, để nuôi cấy tế bào thực vật và động vật cần có môi trường nuôi cấy thích hợp.

III. TẠO THỰC VẬT CHUYỂN GENE

1. Phương pháp chuyển gene gián tiếp

a. Chuyển gene nhờ vi khuẩn

Để chuyển gene vào tế bào thực vật, người ta thường sử dụng các vi khuẩn thuộc nhóm Agrobacterium gồm A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. rubi, A. radiobacter, trong đó, A. tumefaciens là vi khuẩn được sử dụng phổ biến.

Khi mô thực vật bị tổn thương, các tế bào sẽ tiết ra các hợp chất phenol, vi khuẩn A. tumefaciens bị hấp dẫn bởi các hợp chất này và xâm nhập vào trong tế bào thực vật (thường là thực vật Hai lá mầm) dẫn đến hình thành các khối u ở phần tiếp giáp giữa rễ và thân cây. Trên thực tế, vi khuẩn không trực tiếp xâm nhập mà chúng chuyển vào tế bào một loại plasmid đặc hiệu gây hình thành khối u được gọi là Ti plasmid (Tumor inducing plasmid). Trong quá trình lây nhiễm, một đoạn nhỏ của plasmid được gọi là T-DNA tách ra và gắn với DNA trong nhân tế bào, nhờ đó, T-DNA được giữ ổn định trong hệ gene của tế bào.

Để sử dụng làm vector chuyển gene, Ti plasmid được cải biến bằng cách cắt bỏ các gene quy định sự hình thành khối u, việc này vừa làm mất tính gây bệnh vừa làm giảm kích thước của Ti plasmid; còn T-DNA được dùng làm vị trí để gắn gene cần chuyển.

b. Chuyển gene nhờ virus

Bên cạnh vi khuẩn A. tumefaciens, các nhà khoa học còn sử dụng virus kí sinh ở thực vật làm vector chuyển gene. Phương pháp này có các ưu điểm như: virus dễ xâm nhập và có khả năng lây nhiễm nhanh trong cơ thể thực vật, có thể mang các đoạn DNA lớn. Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế: nucleic acid của virus không tích hợp vào nhiễm sắc thể của thực vật nên không được di truyền qua sinh sản hữu tính, sự xâm nhiễm của virus thường làm yếu tế bào thực vật, do đó, phương pháp này ít được sử dụng.

2. Phương pháp chuyển gene trực tiếp

Nhiều kết quả thực tế cho thấy vi khuẩn A. tumefaciens chỉ có thể xâm nhiễm vào cây Hai lá mầm (bông, các cây họ Đậu,...) mà không thể xâm nhiễm vào cây Một lá mầm. Để khắc phục điều này, nhiều kĩ thuật chuyển gene đã được phát triển nhằm chuyển gene trực tiếp vào tế bào thực vật như dùng súng bắn gene, xung điện, vi tiêm, chuyển gene qua ống phấn,...

Chuyển gene bằng hoá chất: Dùng enzyme để loại bỏ thành tế bào, sau đó, cho biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào trần bằng calcium phosphate hoặc polyethylene glycol rồi kích thích để tái tạo lại thành tế bào. Tế bào chuyển gene được nuôi cấy in vitro để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Chuyển gene bằng xung điện: Dùng xung điện cao áp làm dãn màng sinh chất để hình thành các lỗ tạm thời, qua đó, các vector tái tổ hợp có thể di chuyển qua màng. Tuy nhiên, phương pháp này có thể gây chết tế bào một cách đột ngột.

Chuyển gene bằng vi tiêm: Dùng pipette thuỷ tinh nhỏ để tiêm trực tiếp vector tái tổ hợp vào nhân của các tế bào trần. Phương pháp này đòi hỏi cao về các thiết bị và kĩ thuật thao tác.

Chuyển gene qua ống phấn: Vector tái tổ hợp được tiêm vào ống phấn sau khi ống phần mọc qua vòi nhuỵ và đưa tinh tử vào bầu nhuỵ để thụ tinh với noãn.

Chuyển gene bằng súng bắn gene: Đây được xem là một phương pháp hiệu quả để chuyển gene vào tế bào thực vật. Nguyên lí của phương pháp này là dùng các hạt vàng (viên đạn) mang vector tái tổ hợp để bắn vào tế bào thực vật, nhờ áp lực cao của luồng khí helium, các hạt xuyên qua thành tế bào và màng sinh chất để đi vào trong nhân tế bào.

3. Một số ứng dụng của thực vật chuyển gene

Công nghệ chuyển gene đã tạo nên các giống thực vật biến đổi gene mang các đặc tính tốt, đa dạng như có khả năng kháng bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng hàm lượng dinh dưỡng,... Nhờ đó, tăng năng suất kinh tế, giảm chi phí sản xuất, giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu nhằm bảo vệ môi trường. Hiện nay, đã có nhiều giống thực vật chuyển gene thành công và được nhân nuôi rộng rãi.

IV. TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE

Ngày nay, nhờ phương pháp chuyển gene, nhiều giống động vật được tạo ra mang nhiều đặc tính quý mà phương pháp lai hữu tính thông thường không thể thực hiện được. Để chuyển gene vào tế bào động vật, có thể tiến hành bằng ba nhóm phương pháp sau đây:

– Dung hợp tế bào: Cho dung hợp tế bào mang gene mong muốn với tế bào cần chuyển gene hoặc chuyển nhân chứa gene cần chuyển từ tế bào cho vào tế bào nhận.

– Chuyển gene gián tiếp: Sử dụng vector chuyển gene là các loại virus kí sinh ở động vật. Tuy nhiên, cần loại bỏ các gene gây bệnh của virus trước khi được sử dụng làm vector chuyển gene.

– Chuyển gene trực tiếp: Dùng kĩ thuật vi tiêm để chuyển gene vào tinh trùng hoặc hợp tử ở giai đoạn nhân non, sử dụng đột biến chuyển đoạn nhiễm sắc thể.

1. Một số phương pháp tạo động vật chuyển gene

a. Chuyển gene bằng virus

Sử dụng virus làm vector chuyển gene có ưu thế trong việc gắn gene chuyển vào DNA của tế bào nhận; tuy nhiên, virus chỉ mang một đoạn gene có kích thước nhỏ, các virus nhân lên một cách nhanh chóng trong tế bào chủ dẫn đến sản phẩm chuyển gene bị nhiễm virus và giảm chất lượng sản phẩm. Ví dụ: Tạo chuột chuyển gene bằng virus (đã loại bỏ gene gây bệnh) mang gene chuyển được cho lây nhiễm vào phôi ở giai đoạn tám tế bào. Chuột con mang gene chuyển có thể được kiểm tra bằng phương pháp PCR hoặc lai phân tử.

b. Chuyển gene bằng vi tiêm

Chuyển gene ở động vật bằng phương pháp vi tiêm là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay, đặc biệt là tạo chuột chuyển gene (Hình 3.9). Nguyên lí của phương pháp này là chuyển đoạn gene mong muốn vào nhân (của tinh trùng hoặc trứng) trong hợp tử ở giai đoạn nhân non. Sau đó, cấy phôi chứa gene mong muốn vào tử cung của các chuột cái mang thai hộ để sinh ra các chuột con chuyển gene. Người ta có thể tiến hành kiểm tra chuột con mang gene chuyển bằng phương pháp lai phân tử hoặc PCR thông qua phân tích DNA được thu từ chóp đuôi của chuột.

2. Một số ứng dụng của động vật chuyển gene

Chuyển gene ở động vật cho phép tạo các dòng động vật biến đổi gene được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, chăn nuôi, sản xuất các chế phẩm sinh học,... phục vụ cho đời sống của con người. Hiện nay, nhiều loài động vật chuyển gene đã được đưa vào thực tiễn sản xuất và đem lại hiệu quả kinh tế cao.

Mặc dù động vật chuyển gene mang lại nhiều giá trị to lớn cho con người nhưng việc sử dụng động vật chuyển gene cũng được luật pháp kiểm soát hết sức chặt chẽ. Trước khi được sử dụng làm thực phẩm và lưu hành trên thị trường, chúng phải vượt qua được các thử nghiệm rất nghiêm ngặt về an toàn thực phẩm. Công việc này cần phải được thực hiện bởi nhiều cơ quan, nhiều tổ chức của quốc gia, quốc tế để đảm bảo sức khoẻ cho người tiêu dùng.